|
|
Obohacovací techniky užívané ve fosfoproteomice
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Zdráhal, Zbyněk (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů patří mezi nejdynamičtější posttranslační modifikace. Fosforylace hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech, jmenujme např. buněčné dělení, přenos signálu, dynamiku cytoskeletu, regulaci translace, cílení proteinů a metabolizmus. Bohužel, množství fosfoproteinů v buňce často neodpovídá jejich významu, a tak pro jejich detekci bývá nevyhnutelné využít obohacovacích technik. K obohacení může dojít buď ve formě fosfoproteinů, nebo fosfopeptidů, popř. může být zvolena kombinace obou přístupů. Většina obohacovacích strategií je založena na chemické modifikaci fosfátů, afinitě fosfátu ke kladně nabité chromatografické matrici a na použití protilátek. Jednotlivé metody mají své výhody i nevýhody. Navíc kompletnějšího a spolehlivějšího odhalení fosfoproteomu lze obvykle dosáhnout až kombinací několika metod. V posledních pěti letech byly mnohé protokoly vylepšeny a další se nově objevily. Tato bakalářská práce shrnuje současné znalosti o obohacovacích metodách užívaných ve fosfoproteomice. Klíčová slova: fosfoproteomika, obohacování fosfoproteinů, obohacování fosfopeptidů, IMAC, MOAC, oxid titaničitý TiO2, hydroxid hlinitý Al(OH)3, protilátky
|
|
|
Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activated in vitro
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
6 Abstract in Czech Po dopadu na bliznu se zralý pyl tabáku rehydratuje, aktivuje a klíčí z něj pylová láčka. Rehydratace je doprovázena de-represí skladovaných mRNA, z nichž se syntetizují nové proteiny. Při vývoji zralého pylu v rychle rostoucí pylovou láčku se velmi pravděpodobně uplatňují také posttranslační modifikace proteinů, konkrétně fosforylace, jež se podílí na regulaci celé řady buněčných procesů. Vzhledem k tomu, že pouze malý podíl proteinů je v daném okamžiku v buňce fosforylován, bývá nevyhnutelné využít nejrůznější obohacovací techniky. Pro obohacení fosfoproteinů z celkového proteinového extraktu zralého pylu a pylu aktivovaného in vitro 30 minut byla v této diplomové práci aplikována afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu (MOAC), kde byl matricí hydroxid hlinitý. Získaná obohacená frakce byla rozdělena nezávisle dvěma metodami; klasickou dvojrozměrnou elektroforézou (2D-GE) a kapalinovou chromatografií (LC). Hmotnostní spektrometrií (MS) byly analyzovány vzorky získané oběma způsoby dělení, a celkem tak bylo identifikováno 139 fosfoproteinových kandidátů. Fosfopeptidové obohacení využívající oxid titaničitý vedlo k lokalizaci 51 fosforylačních míst, a tak rozšířilo počet přesně identifikovaných fosforylačních míst na celkových 52. Klíčová slova: samčí gametofyt, zralý...
|
|
|
Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activated in vitro
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
6 Abstract in Czech Po dopadu na bliznu se zralý pyl tabáku rehydratuje, aktivuje a klíčí z něj pylová láčka. Rehydratace je doprovázena de-represí skladovaných mRNA, z nichž se syntetizují nové proteiny. Při vývoji zralého pylu v rychle rostoucí pylovou láčku se velmi pravděpodobně uplatňují také posttranslační modifikace proteinů, konkrétně fosforylace, jež se podílí na regulaci celé řady buněčných procesů. Vzhledem k tomu, že pouze malý podíl proteinů je v daném okamžiku v buňce fosforylován, bývá nevyhnutelné využít nejrůznější obohacovací techniky. Pro obohacení fosfoproteinů z celkového proteinového extraktu zralého pylu a pylu aktivovaného in vitro 30 minut byla v této diplomové práci aplikována afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu (MOAC), kde byl matricí hydroxid hlinitý. Získaná obohacená frakce byla rozdělena nezávisle dvěma metodami; klasickou dvojrozměrnou elektroforézou (2D-GE) a kapalinovou chromatografií (LC). Hmotnostní spektrometrií (MS) byly analyzovány vzorky získané oběma způsoby dělení, a celkem tak bylo identifikováno 139 fosfoproteinových kandidátů. Fosfopeptidové obohacení využívající oxid titaničitý vedlo k lokalizaci 51 fosforylačních míst, a tak rozšířilo počet přesně identifikovaných fosforylačních míst na celkových 52. Klíčová slova: samčí gametofyt, zralý...
|
|
|
Obohacovací techniky užívané ve fosfoproteomice
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Zdráhal, Zbyněk (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů patří mezi nejdynamičtější posttranslační modifikace. Fosforylace hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech, jmenujme např. buněčné dělení, přenos signálu, dynamiku cytoskeletu, regulaci translace, cílení proteinů a metabolizmus. Bohužel, množství fosfoproteinů v buňce často neodpovídá jejich významu, a tak pro jejich detekci bývá nevyhnutelné využít obohacovacích technik. K obohacení může dojít buď ve formě fosfoproteinů, nebo fosfopeptidů, popř. může být zvolena kombinace obou přístupů. Většina obohacovacích strategií je založena na chemické modifikaci fosfátů, afinitě fosfátu ke kladně nabité chromatografické matrici a na použití protilátek. Jednotlivé metody mají své výhody i nevýhody. Navíc kompletnějšího a spolehlivějšího odhalení fosfoproteomu lze obvykle dosáhnout až kombinací několika metod. V posledních pěti letech byly mnohé protokoly vylepšeny a další se nově objevily. Tato bakalářská práce shrnuje současné znalosti o obohacovacích metodách užívaných ve fosfoproteomice. Klíčová slova: fosfoproteomika, obohacování fosfoproteinů, obohacování fosfopeptidů, IMAC, MOAC, oxid titaničitý TiO2, hydroxid hlinitý Al(OH)3, protilátky
|
host ::
RSS.